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噬神經(jīng)元的腺病毒載體的構(gòu)建

更新時(shí)間:2021-07-13點(diǎn)擊次數(shù):1235

實(shí)驗(yàn)試劑


人類(lèi)胚胎腎(HEK)293T細(xì)胞

腺病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒

腺病毒包裝載體PLP1,pLP2(之前),PLP / VSVG

DMEM培養(yǎng)基

青霉素,鏈霉素-谷氨酰胺(100X)

磷酸鹽緩沖液PBS(-)

胎牛血清

凝聚胺
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

 

10-cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿

50毫升錐形離心管

Steriflip-GP過(guò)濾器(0.22微米)
超離心管17.0mL

5%二氧化碳培養(yǎng)箱

熒光顯微鏡

生物安全柜

離心機(jī)

 

 
實(shí)驗(yàn)材料


2.5M氯化鈣溶液:36.75克氯化鈣,70毫升雙蒸H 2 O,通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾,體積調(diào)制100毫升

2X HEPES緩沖:氯化鈉280 mM,50mM肝素鈉,1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05)
實(shí)驗(yàn)步驟


腺病毒載體的構(gòu)建和濃度

第1天: HEK細(xì)胞的培養(yǎng)

1.收集預(yù)融合的HEK 293T細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)于*DMEM培養(yǎng)基中(含10%FBS,50 U/ml的青霉素G和50μg/mL鏈霉素的,pH值7.35)。

2.將收集的濃度為1×106 的HEK 293T細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中,加入10mL*DMEM培養(yǎng)基。漩渦震蕩使細(xì)胞均勻分布, 37℃培養(yǎng)24h。

第2天:轉(zhuǎn)染

3.觀(guān)察第1天培養(yǎng)的細(xì)胞,細(xì)胞應(yīng)鋪滿(mǎn)約60%。

注意:細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%會(huì)導(dǎo)致收獲病毒時(shí)PH偏低。

4.更換DMEM培養(yǎng)基(10%FBS,10mL),繼續(xù)孵育于二氧化碳培養(yǎng)箱30min。

5.將10µg腺病毒轉(zhuǎn)移載體與10µg包裝混合物混合,用無(wú)菌ddH2 O稀釋質(zhì)粒至總體積450μL。

6.向質(zhì)粒中加入50μL 2.5 M氯化鈣混勻,然后加入500μl 2xHEPES緩沖液,渦旋。

7.將所有的轉(zhuǎn)染混合物加入(散開(kāi))培養(yǎng)板,輕輕震蕩,繼續(xù)培養(yǎng)于5%二氧化碳培養(yǎng)箱過(guò)夜(16h)。

第3天:觀(guān)察細(xì)胞和更換培養(yǎng)基

8.觀(guān)察細(xì)胞

注意:細(xì)胞不能達(dá)到飽和狀態(tài),應(yīng)該有供細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的空間,因?yàn)榧?xì)胞鋪滿(mǎn)后培養(yǎng)基的pH值會(huì)迅速下降。

9.吸出培養(yǎng)基,加入5mL預(yù)熱的PBS(-)洗兩次細(xì)胞,然后加入9.5mL新鮮培養(yǎng)液的DMEM培養(yǎng)基, 5%CO 2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培育,37℃過(guò)夜。

第4天:收獲細(xì)胞和濃縮病毒顆粒

10.轉(zhuǎn)染40h后收集上清液。

注意:收集時(shí)培養(yǎng)基顏色應(yīng)該是紅色的(酚紅的顏色),(pH值7.20或更高)在這個(gè)pH值內(nèi)病毒培養(yǎng)較好,因此,不要使用從第二次收獲的細(xì)胞。為了獲得優(yōu)先轉(zhuǎn)染膠質(zhì)細(xì)胞的腺病毒載體,應(yīng)使用病毒轉(zhuǎn)染后2d或3d的細(xì)胞。此外,最好使用充足胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞。

11.通過(guò)0.22微米的過(guò)濾器過(guò)濾,清除上清液中的細(xì)胞碎片。

12.超速離心濃縮病毒顆粒。4℃,用吊桶式轉(zhuǎn)頭離心上清120000xg,1.5h。將2個(gè)培養(yǎng)板(約18mL)的上清濃縮于一管。

13.倒掉上清液,沉淀幾乎看不見(jiàn)。

14.用90μL PBS(-)重懸病毒顆粒。病毒懸浮液,可用于在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn):但是,如果需要純凈級(jí)的質(zhì)量,可通過(guò)如下步驟純化病毒。

腺病毒載體滴度的測(cè)定

腺病毒載體的滴度通過(guò)HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染來(lái)測(cè)定。雖然滴度可以在13步后就可以計(jì)算,但為了縮短整個(gè)過(guò)程我們通常從第3天開(kāi)始計(jì)算。

第3天:HeLa細(xì)胞播種

15.將 1×105 的的HeLa細(xì)胞接種于含1mLDMEM培養(yǎng)基(10%FBS)的12孔板,添加聚凝胺至濃度為6 µg/ml。在5%CO2 培養(yǎng)箱孵育,37℃過(guò)夜。

第4天:腺病毒載體的感染HeLa細(xì)胞

16.用PBS 10倍梯度稀釋的病毒(稀釋從10 -3 到10 -6 )。實(shí)際測(cè)試的范圍將取決于病毒制劑的濃度。17.將每個(gè)梯度稀釋的病毒加入單層生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞,輕輕搖勻, 337℃培養(yǎng)。

第5-8天:腺病毒載體的滴度測(cè)定

18.細(xì)胞再生長(zhǎng)3天(感染后總88h),綠色熒光蛋白染色后48h可見(jiàn)。然而,這個(gè)時(shí)間根據(jù)滴定用腺病毒載體和細(xì)胞株不同而有所不同。

19.檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞百分比:如果標(biāo)記是綠色熒光蛋白,計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞。

20.如前所述計(jì)算生物滴度(TU/ml,轉(zhuǎn)染單位)。

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