国产精品日韩精品久久蜜桃,日本一区二区三区视频高清,成人黄色小视频下载网站,黑人巨大精品欧美一区二区久

上海喆圖科學(xué)儀器

Zhetu Scientific Instrument

服務(wù)熱線(xiàn):400-001-0304

技術(shù)文章

ARTICLE

當(dāng)前位置:首頁(yè)技術(shù)文章噬神經(jīng)元的腺病毒載體的構(gòu)建

噬神經(jīng)元的腺病毒載體的構(gòu)建

更新時(shí)間:2021-07-13點(diǎn)擊次數(shù):1235

實(shí)驗(yàn)試劑


人類(lèi)胚胎腎(HEK)293T細(xì)胞

腺病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒

腺病毒包裝載體PLP1,pLP2(之前),PLP / VSVG

DMEM培養(yǎng)基

青霉素,鏈霉素-谷氨酰胺(100X)

磷酸鹽緩沖液PBS(-)

胎牛血清

凝聚胺
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

 

10-cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿

50毫升錐形離心管

Steriflip-GP過(guò)濾器(0.22微米)
超離心管17.0mL

5%二氧化碳培養(yǎng)箱

熒光顯微鏡

生物安全柜

離心機(jī)

 

 
實(shí)驗(yàn)材料


2.5M氯化鈣溶液:36.75克氯化鈣,70毫升雙蒸H 2 O,通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾,體積調(diào)制100毫升

2X HEPES緩沖:氯化鈉280 mM,50mM肝素鈉,1.5mM的Na2 HPO4 (pH值7.05)
實(shí)驗(yàn)步驟


腺病毒載體的構(gòu)建和濃度

第1天: HEK細(xì)胞的培養(yǎng)

1.收集預(yù)融合的HEK 293T細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)于*DMEM培養(yǎng)基中(含10%FBS,50 U/ml的青霉素G和50μg/mL鏈霉素的,pH值7.35)。

2.將收集的濃度為1×106 的HEK 293T細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中,加入10mL*DMEM培養(yǎng)基。漩渦震蕩使細(xì)胞均勻分布, 37℃培養(yǎng)24h。

第2天:轉(zhuǎn)染

3.觀(guān)察第1天培養(yǎng)的細(xì)胞,細(xì)胞應(yīng)鋪滿(mǎn)約60%。

注意:細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%會(huì)導(dǎo)致收獲病毒時(shí)PH偏低。

4.更換DMEM培養(yǎng)基(10%FBS,10mL),繼續(xù)孵育于二氧化碳培養(yǎng)箱30min。

5.將10µg腺病毒轉(zhuǎn)移載體與10µg包裝混合物混合,用無(wú)菌ddH2 O稀釋質(zhì)粒至總體積450μL。

6.向質(zhì)粒中加入50μL 2.5 M氯化鈣混勻,然后加入500μl 2xHEPES緩沖液,渦旋。

7.將所有的轉(zhuǎn)染混合物加入(散開(kāi))培養(yǎng)板,輕輕震蕩,繼續(xù)培養(yǎng)于5%二氧化碳培養(yǎng)箱過(guò)夜(16h)。

第3天:觀(guān)察細(xì)胞和更換培養(yǎng)基

8.觀(guān)察細(xì)胞

注意:細(xì)胞不能達(dá)到飽和狀態(tài),應(yīng)該有供細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的空間,因?yàn)榧?xì)胞鋪滿(mǎn)后培養(yǎng)基的pH值會(huì)迅速下降。

9.吸出培養(yǎng)基,加入5mL預(yù)熱的PBS(-)洗兩次細(xì)胞,然后加入9.5mL新鮮培養(yǎng)液的DMEM培養(yǎng)基, 5%CO 2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培育,37℃過(guò)夜。

第4天:收獲細(xì)胞和濃縮病毒顆粒

10.轉(zhuǎn)染40h后收集上清液。

注意:收集時(shí)培養(yǎng)基顏色應(yīng)該是紅色的(酚紅的顏色),(pH值7.20或更高)在這個(gè)pH值內(nèi)病毒培養(yǎng)較好,因此,不要使用從第二次收獲的細(xì)胞。為了獲得優(yōu)先轉(zhuǎn)染膠質(zhì)細(xì)胞的腺病毒載體,應(yīng)使用病毒轉(zhuǎn)染后2d或3d的細(xì)胞。此外,最好使用充足胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞。

11.通過(guò)0.22微米的過(guò)濾器過(guò)濾,清除上清液中的細(xì)胞碎片。

12.超速離心濃縮病毒顆粒。4℃,用吊桶式轉(zhuǎn)頭離心上清120000xg,1.5h。將2個(gè)培養(yǎng)板(約18mL)的上清濃縮于一管。

13.倒掉上清液,沉淀幾乎看不見(jiàn)。

14.用90μL PBS(-)重懸病毒顆粒。病毒懸浮液,可用于在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn):但是,如果需要純凈級(jí)的質(zhì)量,可通過(guò)如下步驟純化病毒。

腺病毒載體滴度的測(cè)定

腺病毒載體的滴度通過(guò)HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染來(lái)測(cè)定。雖然滴度可以在13步后就可以計(jì)算,但為了縮短整個(gè)過(guò)程我們通常從第3天開(kāi)始計(jì)算。

第3天:HeLa細(xì)胞播種

15.將 1×105 的的HeLa細(xì)胞接種于含1mLDMEM培養(yǎng)基(10%FBS)的12孔板,添加聚凝胺至濃度為6 µg/ml。在5%CO2 培養(yǎng)箱孵育,37℃過(guò)夜。

第4天:腺病毒載體的感染HeLa細(xì)胞

16.用PBS 10倍梯度稀釋的病毒(稀釋從10 -3 到10 -6 )。實(shí)際測(cè)試的范圍將取決于病毒制劑的濃度。17.將每個(gè)梯度稀釋的病毒加入單層生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞,輕輕搖勻, 337℃培養(yǎng)。

第5-8天:腺病毒載體的滴度測(cè)定

18.細(xì)胞再生長(zhǎng)3天(感染后總88h),綠色熒光蛋白染色后48h可見(jiàn)。然而,這個(gè)時(shí)間根據(jù)滴定用腺病毒載體和細(xì)胞株不同而有所不同。

19.檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞百分比:如果標(biāo)記是綠色熒光蛋白,計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞。

20.如前所述計(jì)算生物滴度(TU/ml,轉(zhuǎn)染單位)。

返回列表
  • 服務(wù)熱線(xiàn) 400-001-0304
  • 電子郵箱

    zhushumin@zhetu.com

掃碼加微信

Copyright © 2025 上海喆圖科學(xué)儀器有限公司版權(quán)所有    備案號(hào):滬ICP備14016230號(hào)-3

技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    sitemap.xml

午夜福利1区2区3区-午夜洗澡免费视频网站| 日韩精品亚洲不卡一区二区-成人网在线视频精品一区二区三区| 精品老熟妇一区二区三区-日韩丰满一区二区三区| 国产欧美日本一区二区-一区二区三区亚洲在线播放| 人妻丝袜中文字幕在线视频-亚洲成av人片一区二区三区| 丝袜美腿人妻连续中出-在线观看日韩三级视频| 午夜福利院免费在线观看-久久精品日产第一区二区三区画质| 欧美日韩国产综合四区-爆操极品尤物熟妇14p| 韩漫一区二区在线观看-精品国产免费未成女一区二区三区| 日韩精品亚洲不卡一区二区-成人网在线视频精品一区二区三区| 亚洲最新国产无人区123-黄片一区二区在线观看| 深夜三级福利在线播放-日韩精品一区二区在线天天狠天| 久久精品亚洲国产av久-国产精品视频一区二区免费| 黄色美女网站大全中文字幕-欧美韩国日本一区二区| 国产欧美日本一区二区-一区二区三区亚洲在线播放| hd在线观看一区二区-免费一区二区三区毛片在线| 熟妇勾子乱一区二区三区-欧美爱爱视频一区二区| 欧美mv日韩mv视频-熟妇人妻ⅴa精品中文| 三级a级一级大片在线观看-日韩av有码免费观看| 国产欧美日韩精品一区在线-久久精品视频免费获取地址| 交换朋友的妻子中文字幕-日本美女8x8x8x8| 亚洲一区精品一区在线观看-日本久久久一区二区三区| 精彩亚洲一区二区三区-中文字幕中文字幕在线色站| 国产精品一区二区在线免费-久久精品国产亚洲av热明星| 亚洲欧美激情自拍色图-国产亚洲精品sese在线播放| 亚洲欧美日韩国产一区二区三区-国产欧美日韩一区二区免费| 亚洲欧洲成视频免费观看-国产福利一区二区在线观看| 成人免费资源在线观看-欧美国产日韩高清在线综合| 在线视频成人一区二区-亚洲另类中文字幕在线| 99在线观看精品视频免费-国产极品一区二区三区四区| 一区二区三区日本韩国欧美-日本1区2区3区4区在线观看| 精品一区二区三区av在线-欧美黑人巨大精品一区二区| 亚洲最新国产无人区123-黄片一区二区在线观看| 中文字幕社区电影成人-欧美精美视频一区二区三区| 欧美精品一区二区不卡-精品国产一区二区三区香蕉网址| 久久特一级av黄色片-91社区视频免费观看| 国模自慰一区二区三区-日韩一级黄色片天天看| 中文字幕人妻少妇第一页-隔壁的女孩在线看中文字幕| 丝袜高跟熟女视频国产-熟女少妇亚洲一区二区| 中文字幕人妻少妇第一页-隔壁的女孩在线看中文字幕| 亚洲综合av一区二区三区-高潮又爽又黄无遮挡激情视频|